Analisis histologis merupakan teknik pengamatan sel serta jaringan tubuh ikan yang sering digunakan. Analisis ini bertujuan untuk menghasilkan sediaan histologis yang dapat diwarnai dengan pewarna khusus sehingga dapat diamati secara langsung dengan menggunakan mikroskop cahaya. Tahapan analisis histologis pada ikan meliputi :
1. Pengambilan jaringan ikan. Pada sampel ikan yang masih kecil dapat langsung fiksasi tanpa dipotong. Pada ikan yang berukuran besar diambil jaringan tertentu yang akan diamati dan dimasukkan ke dalam larutan fiksasi.
2. Fiksasi. Larva atau ikan berukukan kecil difiksasi dengan larutan PFA 4% dalam medium Phosphate buffered saline (PBS). Sampel dimasukkan ke dalam botol yang sudah berisi larutan fiksatif dengan perbandingan antara sampel dengan larutan adalah 1:20. kemudian disimpan selama 24 jam dalam refrigerator. Setelah 24 jam kemudian sampel diambil dan dicuci dengan PBS selama 5 menit sebanyak 3 kali untuk menghilangkan sisa-sisa PFA sebelum ke tahap selanjutnya. Ikan yang berukuran relatif besar difiksasi dengan larutan Bouin’s selama 1 minggu dalam suhu kamar. Selanjutnya sampel dicuci dalam larutan alkohol 70% hingga warna kuning hilang, kemudian sampel disimpan dalam alkohol 70% hingga pemrosesan lebih lanjut. Sampel yang berukuran besar harus melaui prosedur dekalsifikasi dalam larutan 5 % trichloroacetid acid selama 24 jam untuk melunakkan struktur tulangnya.
3. Dehidrasi. Sampel yang sudah difiksasi kemudian dimasukkan berturut-turut ke dalam larutan sebagai berikut: Alkohol 70%, Alkohol 80%, Alkohol 90%, Alkohol Absolut I, Alkohol Absolut II, masing-masing selama 45 menit, kemudian dilanjutkan ke proses penjernihan.
4. Penjernihan (clearing). Sampel dari proses dehidrasi dimasukkan ke dalam larutan alkohol:xylol 1:1 dan 1:3 selama 30 menit. kemudian Xylol I dan Xylol II masing-masing selama 30 menit.
5. Infiltrasi. Sampel yang sudah dijernihkan dalam xylol diinfiltrasi secara bertahap dalam campuran xylol : paraffin 3:1 ; 1:1 dan 1:3 masing-masing selama 30 menit, dilanjutkan dengan paraffin murni sebanyak 2 x 60 menit. Seluruh rangkaian infiltrasi dilakukan dalam inkubator pada temperatur 58-60 0C.
6. Penanaman sampel (Embedding). Parafin dicairkan di dalam inkubator pada temperatur 60 0C. Cetakan berukuran 2 x 2 x 2 cm diisi dengan paraffin cair, bagian bawah cetakan didinginkan di atas blok es sehingga paraffin pada dasar cetakan agak memadat. Sampel diletakkan di atas paraffin yang agak memadat tersebut sesuai dengan orientasi irisan yang direncanakan, kemudian ditempelkan holder yang telah diberi label sesuai dengan kode sampel. Cetakan paraffin selanjutnya dibiarkan dalam temperatur ruang agar parafinnya memadat.
7. Pengirisan (Sectioning) dan peletakan pada gelas obyek. Water bathdisiapkan dengan suhu 40-50 0C dan disiapkan wadah berisi air dingin.Kemudian blok yang sudah didinginkan dipasang di mikrotom yang sudah diatur pada ketebalan 4-7 μm. Putaran mikrotom dibuat konstan sampai blok yang berisi sampel jaringan teriris. Setelah itu irisan dipindahkan ke dalam baskom yang berisi air dingin, kemudian ditempelkan pada gelas obyek yang sudah dilapisi gelatin dan diberi kode sama dengan blok yang di iris. Selanjutnya dicelupkan ke dalam air hangat dalam water bath agar irisan mengembang. Kemudian ditiriskan untuk dilakukan pewarnaan.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar